作者姓名：儲昭暉
　　論文題目：水稻白葉枯病隱性抗病基因xa13的分離與鑒定的研究
　　作者簡介：儲昭暉，男，1977年01月出生，1998年09月師從于華中農業(yè)大學王石平教授，于2006年01月獲博士學位。

　　中文摘要
　　植物抗病基因的研究一直以來是植物分子生物學研究領域的熱點之一，迄今已經從不同的宿主中分離了50多個抗病基因，其中僅有6個是隱性基因，這些隱性抗病基因的作用機理目前尚不能用廣為接受的顯性基因的作用機理來進行解釋。水稻中已經鑒定32個主效抗白葉枯病基因，其中9個為隱性抗病基因。位于第8染色體長臂末端的xa13基因就是其中的一個典型，它完全隱性抗性、特異性的抗白葉枯病菌菲律賓菌系生理小種6（PXO99）、和其它顯性或隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作,說明xa13基因抗病機理的特異性。
　　為克隆xa13基因，采用基因組飽和雜交的原理，在9個發(fā)育時期取材構建了水稻品種明恢63全生育期均一化cDNA文庫。以分子標記E6a和另一端標記S14003為起始，構建了xa13基因區(qū)段的物理圖譜，并結合3個F2群體和Shotgun測序結果將該基因定位于一個9.2?kb的DNA片段上。同時通過精細物理定位xa13基因，開發(fā)了數(shù)個與該基因緊密連鎖的基于PCR技術的分子標記，為采用分子標記輔助選擇xa13育種提供了經濟、方便的分子標記。
　　在優(yōu)化了一套適合于水稻品種IRBB13的轉基因組培體系的基礎上，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將攜帶顯性候選基因的片段轉入到攜帶隱性抗病基因的水稻品種IRBB13中，在45株轉基因植株后代中，有全長基因導入的30株的表型變?yōu)楦胁?，并?個單拷貝轉基因的T1代家系也符合共分離檢測，從而驗證了候選基因是xa13基因的顯性基因Xa13，標志用圖位克隆法成功克隆了隱性基因xa13和顯性基因Xa13。同時，通過RNA干擾（RNAi）技術，分別抑制水稻品種明恢63和中花11中顯性基因Xa13的表達，以及水稻品系IRBB13中隱性基因的表達。通過接種白葉枯病菌PXO99和定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，明恢63和中花11中Xa13基因表達受到抑制的植株表型由感病變?yōu)榭共?，IRBB13中xa13基因表達受到抑制的植株抗性進一步加強。
　　有趣的是，顯性基因Xa13和隱性基因xa13在花藥中的表達量高于在葉片中的表達量。RNAi轉基因植株中Xa13或xa13的表達受到抑制會導致植株不育或半不育，組織學觀察發(fā)現(xiàn)這些不育單株的多數(shù)花粉的發(fā)育停留在單核花粉期或二核花粉期。原位雜交的實驗證明，?Xa13基因在花藥中表達的時期與異?；ǚ郯l(fā)生的時期非常一致，Xa13在花粉發(fā)育的早期不表達，在單核花粉期開始高水平表達。從而說明Xa13基因在花粉的發(fā)育中也起著重要的作用。
　　進一步通過大量實驗表明，顯性基因Xa13是一個受病原調控表達的基因，由顯性基因Xa13突變成隱性基因xa13的關鍵不是編碼區(qū)內的變化，而是在啟動子區(qū)的一個約18?bp的區(qū)間內的突變使基因表達受病原調控的能力喪失，且這種突變不影響其在花粉中的表達。XA13蛋白是一個未知具體生化功能的細胞膜蛋白，屬于MtN3家族的成員之一。但其在白葉枯病菌PXO99侵染以及在花粉的發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能，且可能介導新的抗病途徑。因此，本研究通過克隆隱性基因xa13以及它的顯性基因Xa13，不僅揭示了一種新的植物抗病機制：即抑制抗病基因的表達是高效抗病的基礎，而且為研究植物抗病和花粉發(fā)育的關系提供了一個新的起點。

　　關鍵詞：??水稻；白葉枯病；黃單胞桿菌；抗病基因；cDNA文庫；圖位克隆