作者姓名：管沉冰
　　論文題目：從生長錐到胞體的長距離鈣離子信號介導(dǎo)Slit－2引起的神經(jīng)細胞遷移的翻轉(zhuǎn)
　　簡介：管沉冰，男，1980年6月出生，2002年9月師從于中科院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所袁小兵研究員和蒲慕明高級研究員，于2007年7月獲博士學(xué)位。

　　中文摘要
　　神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，從神經(jīng)干細胞的增殖、分化開始，然后遷移到特定位置，最后形成正確的網(wǎng)絡(luò)連接。在這個過程中，神經(jīng)細胞遷移是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的一個重要步驟，靈長類動物的前腦中有109個神經(jīng)元參與遷移，最長的遷移路徑可達數(shù)厘米。這些神經(jīng)元通過遷移到達特定位置，聚集成核團或是形成分層結(jié)構(gòu)，為形成正確的回路做好準備。
　　根據(jù)發(fā)生遷移時所處的發(fā)育階段，可以把中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)細胞遷移分為兩類：胚胎期發(fā)生的遷移和生后進行的遷移。前者以室管膜區(qū)（ventricular?zone，?VZ）剛成熟的神經(jīng)元的遷移為代表，這與大腦皮層、脊髓背角分層等有關(guān)，這些過程基本都在胚胎期即完成。而后者包括小腦顆粒細胞從外顆粒層遷往內(nèi)顆粒層、前腦亞室管膜層（anterior?subventricular?zone,?SVZa）神經(jīng)元經(jīng)頭端遷移流（rostral?migratory?stream,?RMS）遷往嗅球成為中間神經(jīng)元等。這些遷移過程是在生后完成（如小腦顆粒細胞遷移）或是終生發(fā)生（如SVZa往嗅球的遷移）。根據(jù)遷移過程中神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞的相互作用大致又可分為兩類：一類是由膠質(zhì)細胞導(dǎo)向的遷移(glia-guided?neuronal?migration)，另一類是不依附于膠質(zhì)細胞的切向遷移(tangential?migration)。
　　在中樞，神經(jīng)細胞完成遷移要涉及三步：神經(jīng)元命運的決定并開始遷移，這是遷移起始的問題；神經(jīng)元沿特定的途徑和正確的方向遷移，這是遷移導(dǎo)向的問題；神經(jīng)元到達恰當位置停止遷移并開始參與該區(qū)域的構(gòu)筑，這是遷移終止的問題。在這三個階段，不論何種遷移形式，都涉及到許多分子機制。對于遷移的導(dǎo)向問題，在無膠質(zhì)導(dǎo)向的遷移中，在遷移途徑（如RMS）的外圍有排斥遷移的信號分子（如Slit），而在遷移途徑中有一些相關(guān)分子促進遷移（如PS－NCAM、Ephrin等），從而實現(xiàn)限制其遷移的空間位置的作用。在有膠質(zhì)導(dǎo)向的遷移中，原先認為導(dǎo)向作用可能僅由膠質(zhì)細胞完成，但實驗表明僅有放射狀膠質(zhì)存在，不足以決定神經(jīng)元的遷移方向，在同一膠質(zhì)纖維上可以看到相向或相背或來回遷移的神經(jīng)元，這表明膠質(zhì)細胞導(dǎo)向的放射狀遷移中也應(yīng)該有導(dǎo)向分子在起作用。
　　相對于研究神經(jīng)細胞遷移的導(dǎo)向問題，軸突生長錐的導(dǎo)向更早吸引了研究者的興趣。一個世紀前，著名的神經(jīng)生物學(xué)家Ramon?y?Cajal就曾通過觀察染色的神經(jīng)組織作出描述：神經(jīng)軸突頂端的生長錐應(yīng)該能表現(xiàn)出一種運動的活性，并且應(yīng)該和外周的白細胞趨化一樣受到靶組織的吸引或是排斥。近20年來關(guān)于軸突導(dǎo)向的分子研究完全證實了Ramon?y?Cajal的描述，大量的吸引和排斥的分子和它們的受體被發(fā)現(xiàn)，許多內(nèi)在的機制也一點點被揭示。這些導(dǎo)向因子包括最經(jīng)典的導(dǎo)向因子（Netrins,?Slits,?Semaphorins,?Ephrins），神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF,?NGF），胚胎發(fā)育中的成形素（morphogen，?包括Wnt,?BMP,?Shh）等許多分泌形蛋白和固定在膜上的蛋白。
　　有趣的是，這些導(dǎo)向因子幾乎也都參與神經(jīng)細胞遷移的導(dǎo)向作用。而對腦片上和培養(yǎng)的神經(jīng)細胞遷移的觀察發(fā)現(xiàn)，遷移中的神經(jīng)細胞的前方總有一個前導(dǎo)突起（leading?process），前導(dǎo)突起的頂端總有一個類似于軸突生長錐的活躍結(jié)構(gòu)，習(xí)慣上也稱之為生長錐。在遷移運動中，前端生長錐的運動和神經(jīng)元胞體的運動有很好的協(xié)調(diào)。還有觀察發(fā)現(xiàn)，Netrin-1對遷移細胞的吸引作用可能是通過對突起的吸引來實現(xiàn)的。這一切都提示了神經(jīng)細胞遷移的導(dǎo)向和生長錐的導(dǎo)向可能有內(nèi)在的機制聯(lián)系。一個有趣的假設(shè)就是：神經(jīng)細胞的遷移中，導(dǎo)向分子的作用是通過前端生長錐的感受，然后通過一個長距離的從生長錐到細胞胞體的信號協(xié)調(diào)整個神經(jīng)元的運動。當然，也可能胞體獨立感受導(dǎo)向因子作用，而與生長錐無關(guān)。為了研究這個問題，我們用打散培養(yǎng)的小腦顆粒細胞為模型，觀察體外遷移的單個顆粒細胞的生長錐運動和胞體運動，以及它們對外界排斥因子Slit的反應(yīng)。
　　在神經(jīng)細胞遷移和軸突導(dǎo)向的研究中，發(fā)現(xiàn)鈣離子是一個很重要的信號分子。鈣離子的不對稱分布對吸引和排斥的軸突導(dǎo)向、神經(jīng)細胞遷移有關(guān)鍵作用。而鈣離子的自發(fā)振蕩也與生長錐的延伸和神經(jīng)元遷移的速度有著密切的關(guān)系。本論文研究了鈣離子信號在傳導(dǎo)從生長錐到細胞胞體的長距離信號及神經(jīng)元遷移導(dǎo)向中的作用。
　　論文描述的實驗中使用已知對神經(jīng)細胞遷移有排斥作用的分子Slit-2來誘導(dǎo)遷移的翻轉(zhuǎn)。Slit最早于1984年由Nüsslein-Volhard與Wieschaus在對果蠅的突變研究中發(fā)現(xiàn)，當時僅發(fā)現(xiàn)Slit主要在胚胎中線表達。而對Slit功能展開的研究起于1998年，先是發(fā)現(xiàn)其受體Robo（roundabout）突變型果蠅的中線處交叉神經(jīng)元的導(dǎo)向發(fā)生缺陷。1999年的一系列遺傳和生化的研究又發(fā)現(xiàn)，分泌性因子Slit正是Robo的配體，Slit－Robo信號起到了排斥一些軸突，使之無法穿過中線的作用。近來的研究還表明，robo的表達調(diào)控對穿過中線的軸突的不再返回有非常重要的作用。
　　不僅在軸突導(dǎo)向上起到排斥的作用，Slit還對SVZa遷往嗅球的神經(jīng)元的遷移有排斥作用。體外共培養(yǎng)在膠質(zhì)細胞上的小腦顆粒細胞的遷移也能受到Slit的排斥。之后發(fā)現(xiàn)在外周循環(huán)系統(tǒng)中，Slit對具有趨化性的白細胞的遷移也有排斥作用。
　　通過原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，在P0的大鼠小腦中，Purkinje細胞有Slit-2表達，而在外顆粒層的顆粒細胞表達其受體Robo2。猜測這時候Slit-2的排斥作用可能是防止顆粒細胞過早地發(fā)生向內(nèi)顆粒層進行遷移。
　　在實驗中，通過顯微鏡實時觀察的方法，觀察了在排斥因子Slit的濃度梯度下，培養(yǎng)的小腦顆粒細胞的遷移行為，仔細分析了前端生長錐和胞體的運動協(xié)調(diào)。通過鈣離子成像的技術(shù)，研究了在Slit作用下細胞內(nèi)的鈣信號的變化。還通過轉(zhuǎn)染外源性DNA、生化測活和活細胞FRET技術(shù)，檢測了調(diào)節(jié)細胞骨架的中心環(huán)節(jié)——Rho家族鳥苷三磷酸酶在Slit引發(fā)的遷移變化中的參與。
　　通過研究發(fā)現(xiàn)前端生長錐承擔(dān)了感受Slit-2的主要功能，然后這一信號通過從生長錐到胞體的長距離細胞內(nèi)鈣離子波信號傳遞到胞體，并引發(fā)了整個神經(jīng)細胞遷移的翻轉(zhuǎn)。此外，還發(fā)現(xiàn)遷移的顆粒神經(jīng)元的前方聚集了豐富的RhoA蛋白，在鈣波信號引發(fā)的遷移翻轉(zhuǎn)時RhoA的活性是必須的，而且活性的RhoA在遷移翻轉(zhuǎn)過程發(fā)生了重新分布。因此，RhoA的重新分布可能是Slit-2引發(fā)的鈣波信號的下游，并進一步負責(zé)調(diào)控細胞骨架成分的動態(tài)變化。
　　通過施加微濃度梯度和活細胞實時熒光標記觀察等手段，對單個神經(jīng)細胞受導(dǎo)向進行遷移的分子機制進行研究，排除了許多細胞間的干擾因素，使得研究細胞內(nèi)機制更為方便。目前，研究神經(jīng)細胞的遷移仍然是國際上非?；钴S的研究領(lǐng)域，還有許多未解之謎有待揭開。而這些研究對于探索神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的發(fā)育規(guī)律和提供損傷修復(fù)的手段都有極大的意義。

　　關(guān)鍵詞：神經(jīng)細胞遷移，Slit-2蛋白，鈣波，Rho家族鳥苷三磷酸酶RhoA